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    如何選擇內參蛋白?
    2022.03.15   點擊1693次

    Western Blot實驗中經常提到的一個名稱——內參。內參即內部參照,一般是指由管家基因編碼表達的蛋白,它們在各組織和細胞中的表達相對恒定,在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。

    內參的作用很多,其可以確保所有樣本的上樣量一致,可以作為校正蛋白樣品定量以及上樣過程中的誤差,保證實驗結果的準確性,也可以作為空白對照,檢測WB過程中蛋白轉膜是否完全以及發光顯色體系是否正常。

    那么在內參的選擇上面我們應該注意什么呢?

    (1) 根據不同的種屬,比如哺乳動物通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH;植物來源實驗樣本,則可以選擇Plant actin、Rubisco等。

    (2) 根據蛋白大小選擇,一般要選擇目的蛋白與內參分子量相差至少5kD以上,才便于對結果分析。且當研究的蛋白的分子量與內參接近時,需要選擇分子量與目的蛋白的分子量差距比較大的蛋白。常用內參蛋白的分子量大小見表1。

    (3) 根據研究靶蛋白的定位選擇內參,比如核蛋白內參可以選擇Lamin B、Histone H3等。小編已經將不同來源的蛋白對應常用的內參蛋白信息匯總如下表:

    表1. 不同來源的蛋白對應的常用的內參蛋白

    樣本類型常用的內參蛋白分子量大小(kDa)
    全細胞蛋白β-actin43
    β-tubulin55
    Cyclophilin A55
    GAPDH37
    α-actin43
    α-tubulin55
    Cyclophilin A18
    Vinculin116
    線粒體蛋白Hsp6060
    VDCA1/porin31
    核蛋白Histone H1/H3 
    Lamin B166
    PCNA29
    TATA binding protein TBP38
    HDAC155
    細胞骨架β-actin43
    β-tubulin55
    α-actin43
    α-tubulin55
    Cofilin20
    血清蛋白Transferrin77

    (4)根據實驗的具體條件選擇,有些實驗條件會對管家基因的表達有影響而導致部分管家基因不適合做改條件下的內參基因,比如于組織缺氧、糖尿病等因素會導致GAPDH的表達增高,不適合做內參,凋亡實驗時,Lamin等也不適合作為內參。

    (5)根據樣本類型選擇內參,比如做各種分泌液樣本的時候,如血漿、乳汁、組織液等,由于沒有完整的細胞結構,只能選擇一些分泌蛋白作為內參。

    介紹完了內參的選擇,下面我們來介紹下今天的主角GAPDH、β-actin和β-tubulin。這3個WB實驗中最常用內參。

    1. GAPDH抗體

    【GAPDH】甘油醛-3-磷酸脫氫酶,是參與糖酵解的一種關鍵酶,催化糖酵解的第六步,它還參與核轉錄等事件,核糖核酸轉錄、DNA復制和修復以及細胞凋亡。由4個30-40 kDa的亞基組成,分子量146kDa,檢測條帶大約在36kDa。GAPDH基因幾乎在所有組織中都高水平表達,廣泛用作WB的內參。

    2. β-Tubulin抗體

    Tubulin即微管蛋白,是細胞的一種骨架蛋白。Tubulin分為α、β、γ、δ、ε等多種tubulin,其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成異源二聚體,是形成微管的最主要的兩種Tubulin。α-tubulin和β-tubulin分子量分別為55kDa和50kDa,其實際檢測條帶均在55kDa左右。作為內參,β-tubulin的蛋白水平通常不會發生改變,因此被廣泛用于Western Blotting時上樣量是否一致的參照,α-Tubulin和β-Tubulin構成微管蛋白的結構也常被用于免疫染色觀察細胞的微管結構。

    3. β-Actin內參抗體

    Actin即肌動蛋白,是細胞的一種重要骨架蛋白。Actin大致可分為六種,其中四種是不同肌肉組織特異性的,其余兩種廣泛分布于各種組織中,包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作為內參是得到了公認的,這是針對大多數組織和細胞來說的,它廣泛分布于細胞漿內,表達量非常豐富,其含量占所有細胞總蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情況下,如脂肪組織或細胞β-Actin抗體推薦—高效價的內參抗體內,β-Actin的表達量就很少。β-actin由375個氨基酸組成,分子量大小為42-43kDa左右。

    以上三種內參可以滿足80%以上的WB實驗需求,Abbkine推出的通用內參抗體雞尾酒,是一種包含了免疫實驗(WB、IHC-P、IF)過程中常用的抗體β-Actin、GAPDH和β-Tubulin以及抗體稀釋液的套裝,并提供了陽性對照,是WB等實驗內參的不二之選。

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